Houyou

Rôle et intérêt des isotopes stables dans l’exploration du métabolisme primaire azoté chez le colza. Détection du 15N par RMN et par CPG-SM

N. Houyou, A. Roscher et C. Pau-Roblot
UMR-CNRS 6022 Génie Enzymatique et Cellulaire, Université de Picardie,
33 rue Saint Leu, 80039 Amiens Cedex

Parmi les techniques permettant la détection des isotopes stables, il y a la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM). La RMN est une technique non destructive et non invasive dont l’application à la biologie est incessamment en expansion. Grâce à cet outil, l’analyse non destructrice peut être utilisée pour étudier le métabolisme d’organismes vivants tel que les bactéries, les plantes, les animaux ainsi que les tissus biologiques isolés.
A l’inverse de la RMN, la CPG-SM est une technique destructive nécessitant une transformation chimique préalable (dérivation) de l’échantillon à analyser. Cependant, elle permet de fournir des informations complémentaires à celles obtenues par RMN. Ces deux techniques ont la particularité non seulement de détecter les isotopes stables mais aussi de déterminer la composition chimique des molécules enrichies.
Notre étude focalise sur le métabolisme des plantes et plus précisément sur celui du colza. En effet, nous avons recours à la RMN du 15N in vivo et in vitro ainsi qu’à la CPG-SM afin d’explorer le métabolisme azoté primaire de cette plante. Cet ensemble de techniques permet l’identification des composés organiques azotés, principalement acides aminés, et la mesure de leurs concentrations ainsi que l’étude cinétique de leur métabolisme en suivant le marquage 15N. L’intérêt d’étudier l’assimilation de l’azote au niveau des parties aériennes de colza provient de l’observation d’une augmentation anormale du taux de transcription de la nitrate réductase (NR) ainsi que d’une augmentation parallèle de son activité enzymatique [1]. Ceci est observé seulement au niveau des parties aériennes de colza suite à une exposition des plantules à l’ammonium. Cette activation par l’ammonium est 2.5 fois plus élevée que la valeur obtenue avec le nitrate.
Nous essayons donc par utilisation du 15N de vérifier si les flux métaboliques azotés sont aussi modifiés par cette augmentation de l’activité enzymatique, et puis de comprendre les régulations métaboliques à la base de l’effet observé.
Pour mieux appréhender les relations entre l’incorporation, la distribution et les interactions de l’azote et le carbone dans le métabolisme de la plante, des sources azotées, ammonium (NH4+) et nitrate (NO3-), enrichis en 15N (99%) ont été introduits dans le milieu nutritif lors de l’analyse par RMN. Ceci a été effectué après culture des plantules de colza en milieu liquide avec une source d’azote non enrichi (NH4+ ou NO3-). L’incorporation du 15N dans les parties aériennes de colza (cotylédons et hypocotyle) isolées a été suivie en temps réel par RMN in vivo.
Une extraction du tissu végétal a été effectuée ensuite afin d’analyser l’extrait par RMN in vitro puis par CPG-SM. Ces analyses par RMN in vitro complétées par la CPG-SM permettent d’évaluer l’incorporation globale et surtout de déterminer les pools d’acides aminés enrichis et non enrichis.

[1] : O. Leleu. Thèse de l’Université de Lille I, UFR de biologie (2000)

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